猪miRNA的研究进展

    摘要：微小RNA(miRNA)是一类长度为l8～24 nt的非编码RNA，以序列特异性方式调控着基因表达。猪作为重要的；肉品动物，其各方面的基因调控已日益引起人们关注，其中小RNA因在动物生长过程中起着重要的调节作用而在近年来交渐成为研究的热潮。目前已报道的猪miRNA仅有78个。作者对已报道的猪miRNA的研究进展特别是与肌肉和脂肪相关的miRNA进行了综述。  

关键词：猪；miNRA；进展

    miRNA是一类内源性的短小RNA，其家族能够通过与靶mRNA的3 ^，端非翻译区(UTR)完全或不完全配对而降解靶mRNA或抑制mRNA的正常翻译，进而对基因转录后表达进行调控。miRNA最初于1993年在秀丽线虫中被发现，当时Lee等在研究线虫发育缺陷时发现lin-4基因不编码蛋白质，但能时序调控秀丽线虫胚胎后期发育的基因。然而 lin一4的发现没能引起太大的关注，直至2000年Re- inhart等在线虫中又发现了第2个类似功能的 miRNA let-7基因，才渐渐掀起一股miRNA的研究热潮。近年来的研究结果发现，miRNA参与调控了NgL动物一系列的生物学过程，包括细胞的生成、分化、增殖及凋亡，心肌和骨骼肌的发育，神经发生，免疫调节应答，脂肪分化及疾病的发生(Esau等，2004；Wienholds等，2005)。特别是在癌症的发生及治疗上的一些突破，使得人们对哺乳动物的研究日益增多，这当中以人和小鼠为主。而猪作为中国第一大肉品动物，其生长及肉品质也逐渐受到大家的关注。目前miRNA在畜牧业中的研究报道还不多见，但近两年来的发展极为迅速，迄今为止， miRNA数据库(http：／／miRNA.sanger，ac.uk／se— quences／help／summary.shtml)可查询到的miRNA达9539个，其中猪的有78个。

1  miRNA参与猪骨骼肌与心肌的发育

    猪作为主要的肉品提供者，首先关注的就是猪的肉品质及肌肉的发育调控。猪肌肉的大小主要是由肌纤维的数量和长度所决定，其中肌纤维的数量在出生前就已经决定了，出生后肌纤维的数量不会发生变化，只是随着年龄的增长其长度和直径逐渐增加。初级肌纤维的形成大概从怀孕后30 d开始，到了50～60 d，肌原细胞在原有的初级纤维表面进行排列，融合，开始形成二级肌纤维(Zhao等，2003)。因此寻找调控这些过程的miRNA对于调节肌肉生长具有深刻的意义。据目前研究报道，肌肉特异性小RNA主要有在骨骼肌及心肌特异表达的miRNA-1与miRNA-133，在骨骼肌特异表达的 miRNA-206(Sempere等，2004)及在心肌中表达的 miRNA-208(van Rooij等，2007)。另外还有些小 RNA如miRNA-95、miRNA-128、miRNA-302、 miRNA-399等也被报道为肌肉特异性基因，但目前仍缺乏其他试验进行证明(Lee等，2008)。miR-1．1和mi-1-2最初发现在小鼠的心肌与骨骼肌前体细胞中特异表达，且在转录的过程中受得生肌分化因子MyoD、Mef2和SRF的调节(Zha0等，2003)。 Chen等(2006)研究结果发现，miRNA一1与miR- NA-133位于同一条染色体上，在发育过程中以组织特异性方式共同转录，但却有着不同的调节功能。 miRNA-1通过与组蛋白脱乙酰基酶4(HDAC4)，一种肌肉基因表达的转录抑制因子结合，促进成肌细胞分化成成熟的肌肉细胞，但却抑制它们的增殖。而miRNA-133则是通过抑制血清应答因子(SRF)加快成肌细胞的增殖速度，同时也抑制着它们的分化。

    在各个物种中，从低等到高等，均能检测到 miRNA-1与miRNA-133的存在。可见这2个小 RNA的正常表达对于肌肉的发育起着至关重要的作用。对发育不全的果蝇进行miR一1的研究结果发现，miR一1不影响幼虫肌序生理功能的形成，但却是有丝分裂后幼虫肌肉的生长所必需的(Sokol等，2005)。Chen等(2006)在其研究中也揭示，miR-NA-1与miRNA-133只在成年动物的肌肉中表达，胚胎期表达量特别少，如果在非洲蟾蜍单细胞时期注射miRNA-1会导致轴前结构减少，前后轴明显缩短，背腹轴拉长而使整个体形变粗。虽然体节仍能形成但已不能正常发育，且胚胎期心脏无法形成。而miRNA一133的异常表达亦会缩短体轴结构，影响体节发育，只是体轴缩短的程度没有miRNA一1异常表达时高，但体节缺失比较严重，心脏组织严重变型。在小鼠中，如果在心脏发育阶段miR-1过度表达，miR-1会与转录因子结合，促进心肌细胞膨胀，从而抑制肌肉的增殖(Zha0等，2003)。此外，若干研究结果也显示，miRNA-1与miRNA-133在肥大的骨骼肌与心肌中表达量会明显下降(Chen9等，2007；McCarthy等，2007；van Rooij等，2006)。说明骨骼肌与心肌的正常发育需要miRNA-1与miR- NA-133的适时及适量表达。

    相对于miRNA-1与miRNA-133，肌肉调节因子miRNA-206的研究比较少，但它只在骨骼肌中特异表达，其研究进展为研究猪肌肉发育调节奠定了坚实的基础。miR-206最初是通过基因芯片分析鉴定(Ba skerville等，2005)，而后又通过Northern blottin9证实确定为骨骼肌特异基因(Kim等，2006)。miR-206和miR-133共同作用，能够在不改变Cx43 mRNA水平的基础上与间隙连接蛋白43(Cx43)的间隙结合通道结合，抑制肌原细胞融合。通过比对发现miR-2068 nt的种子序列“seed”与 Cx43的3'-UTR有两个结合位点，这种现象在大鼠、小鼠和人等不同物种中也是保守的(An derson等，2006)。陈俭海等(2007)通过查询猪的相关序列发现猪成熟的miR-206序列中也有8 nt碱基与人的种子序列一致，表明猪的miR-206可能也具有类似的功能。miR-206还能促进骨骼肌分化，抑制 miR-206将使肌原细胞退出细胞周期并阻止细胞分化(Ra0等，2006)，另有研究结果发现，miR-206能够负调节DNA聚合酶翻译，抑制DNA的合成，进而促进细胞分化，这也与上述结果一致(Kim等，2006)。Ra0等(2006)也指出miR-1、miR-133和 miR-206等肌肉特异性miRNA在成肌细胞向肌束转变阶段被强烈诱导表达。以上一系列研究报道均证明，miR-206在肌肉分化及发育过程中起到重要的调节作用。另外有研究报道指出，这些肌肉特异因子也能够影响家畜的生长性能(Clop等，2006)。 Huan9等(2008)选用33、65胎龄猪及成年猪背最长肌进行miRNA的表达谱分析比较，结果发现，检测到的miR-1和miR-133在各个时期的表达量均无显著差异，表现为高水平表达。而相比65胎龄猪，成年猪中miR-206的表达量则提高了2．9倍。为了验证miRNA在胎猪肌肉发育中的作用，Mc- Daneld等(2008)选了3个时期的猪作为研究对象，包括初级肌纤维发育的60胎龄，二级肌纤维发育的90胎龄及105胎龄，并将成年猪作为对照，各时期取4头公猪和4头母猪的股二头肌跟背最长肌，混合一起构建miRNA文库，检测miRNA的表达，结果得到了95个miRNA，其中有3个是新发现的。试验结果还发现，肌肉特异性miR-206在各个时期的股二头肌和背最长肌中表达量都是最高的，另外一个肌肉特异性miR-1基因在整个胚胎期都处于适中表达，其中105胎龄的表达量相对较高。而 miR-133在整个胚胎期不是没检测到信号就是表达量非常低。McDaneld等(2009)对各发育阶段的猪肌肉组织进行大量的miRNA检测，包括处于增殖期的卫星细胞(4、5和6代)，胎儿生长发育的3个阶段(60、90和105 d)及成年时期。检测到了l2个新的小RNA，同时发现，肌肉特异性miR-206基因几乎不存在于增殖期的卫星细胞，但在其他检测的阶段中却是表达量最高的一个。miR-1除了在成年猪中高度表达外，其他阶段都是中度表达，miR-1在成年猪肌肉中中度表达，在胚胎期或新生猪中要么没检测到要么表达度很低，而Naguibneva等(2006)也发现，miR-181虽然在很多组织中都能检测到有表达，但它能在哺乳动物成肌细胞分化期间下调分化抑制因子Hox-All的表达，从而影响肌肉的分化表型。www.powerpigs.net

   虽然mNR-1和mNR-206均能促进骨骼肌细胞分化，但McDaneld等(2009)的试验数据表明，这2个基因在发育过程中起着不同的作用。mNR-1需要在胚胎后期降低活性从而影响靶基因的调节作用，mNR-206则持续起着在分化后立即抑制靶基因的作用，而从表达丰度上看，作者认为在胚胎期 mNRN1和mNR-206比mNRNA-133发挥的作用更大。

2 mNRNA参与脂肪生成代谢

  除了肌肉的生长发育会影响畜牧业的经济状况外，瘦肉率也是影响屠体价值的一大因素，因此调节脂肪组织生长代谢的研究也具有较大的经济意义。有关猪脂肪代谢相关mNRNA的报道极为少见，但  mNRNA保守性很高，且功能相似性很大，因此其他  物种，特别是哺乳动物其脂肪相关mNRNA报道具  有高价值的参考性。

    Xu等(2003)研究结果发现，细胞死亡抑制因子  miR-14能够调节细胞周期，并通过改变三酰基甘油  与二酰基甘油之间的水平调节脂肪代谢。在miR-  14基因敲除的动物体内，三酰基甘油和甘油二酯的  含量增加，过量表达miR-14则减少。Esau等  (2004)发现在分化的脂肪细胞中miR-143表达明  显升高，而抑制miR-143会导致脂肪细胞分化受  限，此外该试验还证明，miR-143的作用靶点是细胞  外调节激酶5(ERK5)，反义寡核苷酸(A SO)抑制  miR-143会使ERK5的表达显著增加。Esau等  (2006)在之后的研究中又发现抑制正常小鼠miR-122的表达能减少血浆胆固醇水平，增加肝脏脂肪  酸代谢，且降低肝脏脂肪酸及胆固醇的合成速率。  而抑制肥胖小鼠模型miR-122的表达除了降低血  浆胆固醇水平外，会明显促进脂肪变性，且脂肪生成  基因表达减少。Wang@(2008)发现在脂肪前体细  胞3T3L1细胞分化中，miR-17-92表达明显增加，稳  定转染miR-17-92的3T3L1细胞将加快细胞分化  速度，增加甘油三酯的沉积，且进一步证实其靶位点  为Rb2／pl30的37端非翻译区(37 UTR)。Rb2／p130的敲除表现为miR-17-92的过量表达。Wil- fred等(2007)根据生物学信息探索了人miR-103  和miR一107在脂肪代谢中的作用，结果发现这2个  小RNA可能通过与泛酰酸激酶(PANK)完全互补  调节细胞的乙酰辅酶A和脂肪水平。而关于猪脂  肪相关miRNA目前报道还比较少，Redd

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